ECL化學(xué)發(fā)光底物（超敏）

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

 ECL超敏發(fā)光液用于檢測(cè)直接或間接標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶HRP的抗體及其關(guān)聯(lián)的抗原。 

用途：用于HRP標(biāo)記抗體的Western Blot和HRP標(biāo)記探針的核酸雜交。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1、靈敏度高：可檢測(cè)低皮克級(jí)的蛋白；

2、信號(hào)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)：光信號(hào)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)5小時(shí)；

3、穩(wěn)定試劑：工作液在24小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定；

4、成像方法：適用于X射線膠片、CCD或激光凝膠成像儀；

5、價(jià)格經(jīng)濟(jì)：針對(duì)稀釋的抗體濃度條件進(jìn)行了優(yōu)化，節(jié)省抗體：

一抗：以1 mg/mL儲(chǔ)存液稀釋1:1,000至1:4,000倍

二抗：以1 mg/mL儲(chǔ)存液稀釋1:2,000至1:5,000倍

6、簡(jiǎn)單易用：可替代其它公司的ECL發(fā)光底物，操作步驟無(wú)需進(jìn)行特別優(yōu)化；

使用方法:

1、執(zhí)行常規(guī)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜和Western Blot步驟。注意用HRP標(biāo)記IgG或用一抗-鏈親和素-生物素-HRP夾法。

2、 Western Blot最后一次洗膜的同時(shí)新鮮配制發(fā)光工作液：分別取等體積的溶液A和B，放入干凈容器中混合。建議立即使用工作液，室溫放置數(shù)小時(shí)后仍可使用但靈敏度略有降低。

3、 用鑷子取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液但勿使膜完全干燥。將膜完全浸入發(fā)光工作液（0.125mL發(fā)光工作液/cm2膜）中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3分鐘，準(zhǔn)備立即壓片曝光。孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不會(huì)增加靈敏度，有時(shí)還會(huì)導(dǎo)致曝光條帶異常。發(fā)光過(guò)程的本質(zhì)是酶促反應(yīng)，使用過(guò)少的發(fā)光工作液不利反應(yīng)進(jìn)行，也會(huì)導(dǎo)致膜上條帶曝光不均和明顯降低靈敏度。為達(dá)節(jié)約目的可將膜剪小但勿降低發(fā)光液用量。

4、 用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝干發(fā)光工作液。但勿洗去發(fā)光液。

5、 打開(kāi)X光膠片暗盒，在暗盒內(nèi)表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將Western Blot膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來(lái)完全包裹Western Blot膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋Western Blot膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi)，蛋白帶面向上。

6、 暗房?jī)?nèi)壓X光膠片，分別曝光不同的時(shí)間，如數(shù)秒到數(shù)分鐘。顯影沖洗。建議*一次曝光 60 秒，之后可調(diào)整曝光時(shí)間以達(dá)到*佳結(jié)果。化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在底物孵育后的前 5-30 min期間是最強(qiáng)烈的。這一反應(yīng)可以持續(xù)幾個(gè)小時(shí)，但強(qiáng)度會(huì)隨時(shí)間下降，如有底物孵育后較長(zhǎng)時(shí)間后曝光，曝光時(shí)間可能需要延長(zhǎng)以獲得較強(qiáng)信號(hào)。          

注意事項(xiàng)：

（1）步驟1～5可在日光燈下操作；但發(fā)光液曝露于強(qiáng)光下時(shí)間過(guò)久靈敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。

（2）長(zhǎng)時(shí)間曝光或蛋白過(guò)量，將加深背景并使條帶強(qiáng)弱變化失去線性關(guān)系。曝光不足則條帶模糊。

（3）發(fā)光工作液孵育約3分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強(qiáng)條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見(jiàn)，低豐度蛋白條帶發(fā)光較弱甚至肉眼不可見(jiàn)但可使X光膠片曝光。肉眼不可見(jiàn)的熒光實(shí)際上可持續(xù)數(shù)小時(shí)并使X光膠片感光，因而弱帶可曝光1-10小時(shí)。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL發(fā)光和曝光。

（4）由于超敏發(fā)光液極其靈敏，建議按照推薦比例稀釋抗體。抗體濃度過(guò)高將造成高背景或沒(méi)有條帶，導(dǎo)致失敗。

（5）某些保鮮膜包裹印跡膜時(shí)可能會(huì)淬滅熒光，應(yīng)選擇高質(zhì)量保鮮膜。

（6）使用肉眼可見(jiàn)的預(yù)染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標(biāo)簽可精確確定膠片上條帶的位置和大小。

（7）疊氮鈉是 HRP 的抑制物，不要使用疊氮鈉作為緩沖液的防腐劑。

保存條件：

  室溫運(yùn)輸，4 ℃密封避光保存一年，短期可放置室溫。