Readilink iFluor 647蛋白標(biāo)記試劑盒提供了一種以微觀方式標(biāo)記抗體的便捷方法。該試劑盒僅需要兩個(gè)簡(jiǎn)單的混合步驟而無需純化步驟。 試劑盒中使用的iFluor 和mFluor 染料的琥珀酰亞AN酯（SE）顯示出與蛋白質(zhì)的脂族AN的良好反應(yīng)性和選擇性，并形成羧酰AN鍵，其與天然肽鍵相同且穩(wěn)定。 iFluor 和mFluor-抗體綴合物可用于免疫熒光染色，熒光原位雜交，流式細(xì)胞術(shù)和其他生物學(xué)應(yīng)用。 每個(gè)Readilink 抗體標(biāo)記試劑盒都提供了進(jìn)行兩次偶聯(lián)反應(yīng)（2x50μg蛋白質(zhì)）的所有必需成分。 每個(gè)試劑盒可用于標(biāo)記50-100μg單克隆，多克隆抗體或其他蛋白質(zhì)（> 10 kDa），只需兩個(gè)簡(jiǎn)單的混合步驟。Readilink iFluor 647蛋白標(biāo)記試劑盒是美國(guó)AAT Bioquest研發(fā)的產(chǎn)品。

標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（標(biāo)記50μg蛋白質(zhì)）

將所有組分加熱并在打開前將樣品瓶短暫離心，并在開始結(jié)合前立即準(zhǔn)備所需的溶液。 以下SOP是標(biāo)記抗HDAC IgG抗體的實(shí)例。

1.準(zhǔn)備蛋白質(zhì)溶液（溶液A）：

為了標(biāo)記50g蛋白質(zhì)（假設(shè)目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度為1mg / mL），將5L（總反應(yīng)體積的10％）的反應(yīng)緩沖液（組分B）與50L目標(biāo)蛋白質(zhì)溶液混合。

注1.如果您的蛋白質(zhì)濃度不同，請(qǐng)相應(yīng)調(diào)整蛋白質(zhì)體積，使~50μg蛋白質(zhì)可用于標(biāo)記反應(yīng)。

注2：為了標(biāo)記100g蛋白質(zhì)（假設(shè)目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度為1mg / mL），將10μL（總反應(yīng)體積的10％）反應(yīng)緩沖液（組分B）與100μL目標(biāo)蛋白質(zhì)溶液混合。

注3：蛋白質(zhì)應(yīng)溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中;如果蛋白質(zhì)溶解在甘氨酸緩沖液中，必須用1X PBS（pH 7.2-7.4）透析，或使用Amicon Ultra-0.5，Ultracel-10膜，10 kDa（來自Millipore的cat＃UFC501008）去除廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的游離AN或AN鹽（如硫酸AN和乙酸AN）。

注4：不純抗體、牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩(wěn)定的抗體不會(huì)被很好標(biāo)記。

注5：如果蛋白質(zhì)濃度小于1 mg / mL，則結(jié)合效率顯著降低。為獲得標(biāo)記效率，建議終蛋白質(zhì)濃度范圍為1-2 mg / mL。

2.運(yùn)行結(jié)合反應(yīng)：

2.1將蛋白質(zhì)溶液（溶液A）加入一瓶標(biāo)記染料（組分A）中，通過反復(fù)移液幾次將其混合均勻，或?qū)⑿∑繙u旋幾秒鐘。

注意：使用標(biāo)記染料的兩個(gè)小瓶（組分A）通過將100μg蛋白質(zhì)分成2x50μg蛋白質(zhì)并使每個(gè)50μg蛋白質(zhì)與一小瓶標(biāo)記染料反應(yīng)來標(biāo)記100μg蛋白質(zhì)。 將兩個(gè)小瓶合并用于下一步。

2.2將綴合反應(yīng)混合物在室溫下保持30-60分鐘。

注意：如果需要，可以旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)綴合反應(yīng)混合物更長(zhǎng)的時(shí)間。

3.停止共軛反應(yīng)：

3.1添加5 L（對(duì)于50μg蛋白質(zhì)）或10L（對(duì)于100μg蛋白質(zhì)），其為TQ染色猝滅緩沖液（組分C）的總反應(yīng)體積的10％到綴合反應(yīng)混合物中（來自步驟2.2），將它們混合 好。

3.2在室溫下孵育10分鐘。

3.3標(biāo)記的蛋白質(zhì)（抗體）現(xiàn)在可以使用了。